菌类文献

大球盖菇液体菌种制备技术要点

一、生物学特性

(一)菌种形态

大球盖菇菌丝双核,洁白,具有锁状联合,菌落呈絮状,绒状。

(二)营养

碳素营养以葡萄糖最好,依次为蔗糖、淀粉、纤维素、木质素。氮素营养可吸收利用氨基酸,不能直接吸收利用蛋白质、硝酸氮。所需矿质元素包括钙、磷、钾、铁、铜等。

(三)温度

温度是控制大球盖菇菌丝生长的一个重要的因子。菌丝体生长温度范围为5℃-3 0℃,最适温度为23℃-28℃。

(四)水分

水分是大球盖菇菌丝及子实体生长不可缺少的因子。基质中含水量的高低与菌丝的生长及长菇量有直接的关系,菌丝在基质含水量65%-80%的情况不能正常生长,最适含水量为70%-75%。

(五)酸碱度

大球盖菇在pH值为4.5-9均能生长,但以pH值为5-7的微酸性环境较适宜。在pH值较高的培养基中,前期菌丝生长缓慢,但在菌丝新陈代谢的过程中,会产生有机酸,而使培养基中的pH值下降,pH值为6左右时,大球盖菇菌丝生长最快。

(六)空气

大球盖菇属于好气性真菌,在菌丝生长阶段,对通气要求不敏感,空气中的二氧化碳浓度可达0.5%-1%。

二、生产工艺流程

母种-抽滤瓶液体菌种-发酵罐培养料制备-发酵罐灭菌-接种-培养-检测-生产接种。

三、生产关键技术

(一)母种活化复壮

1.活化培养。将保存母种取出,置于培养箱中培养,温度设置23℃。

2.复壮培养基配方。土豆20%,琼脂2%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾0.3%,硫酸镁0.15%,水1000ml。

3.培养基制备。先将土豆洗净去皮,再称取200g切成1cm³左右小块,加水煮沸20min-30min,能被玻璃棒戳破即可,用8层纱布过滤,继续加热,边加入琼脂边搅拌混匀,再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁,溶解后补足水分至1000ml,分装试管,加塞、包扎,高压灭菌锅灭菌121℃30min,取出试管摆斜面,冷却后贮存备用。

4.接种培养。在无菌条件下取母种尖端菌丝,并用接种钩将菌丝接入试管培养基中部,置于培养箱中25℃黑暗培养。

(二)抽滤瓶液体菌种生产

1.生产配方。豆粕粉4g,玉米粉3g,葡萄糖20g,蛋白胨3g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁1g,净化水1000ml。

2.培养基制备。称量上面所有原料,要求每瓶分别称量,主要防止各瓶营养物质不均衡。每瓶2500mL抽滤瓶,将上面原料全部加入,滴一滴消泡剂,一个搅拌子,一片VB1。塞上硅胶塞,用一次性口罩2个交叉盖严硅胶塞及瓶口,用橡皮筋扎紧,因卧式灭菌器灭菌后会在高压条件下自动排汽,防止硅胶塞跳出,需要用细铁丝拧紧瓶口。

3.灭菌。将抽滤瓶竖直放入灭菌器,121℃灭菌45分钟,灭菌器排汽降温后,灭菌室压力归零及时将抽滤瓶取出,因灭菌时间多加了15分钟,闷锅时间过长会损失过多营养物质。放置室温无菌环境下冷却至28℃,再放入超净工作台内。

4.接种。将抽滤瓶、酒精灯、接种钩、两把镊子、75%酒精棉、75%小酒精喷壶、生产用母种放入超净,母种远离紫外线灯一侧,盖上一次性口罩,开启紫外线灯消毒20分钟。然后开启风机,关掉紫外线灯,打开照明灯,戴上一次性橡胶手套,酒精消毒手及手臂、工作台接接钩、抽滤瓶。点燃酒精灯,灼烧接种钩放至一侧镊子上备用,将抽滤瓶去掉一次性口罩,用火焰围绕瓶囗灼烧灭菌(可拿酒精灯或使用提前镊子夹少许酒精棉点燃灼烧),用接种钩将母种在火焰保护下按压挤碎,取小指甲盖大小一撮菌种,一手拿接种钩,一手打开抽滤瓶瓶塞,放入菌种后迅速塞上瓶塞,盖上一次性口罩。

5.培养。抽滤瓶放入全温摇床上25℃,150r/mⅰn,培养4天,将有豆粒大小菌球出现,放到磁力搅拌器上打碎菌球,以增加萌发点。24小时后再放至全温摇床内培养两天,然后取出放至磁力搅拌器上,控制好搅拌子转速,防菌液溅到瓶身上部。此时要确定菌球大小基本都在黄豆粒大以下为好,菌球总量占总体积4/5为宜。

(三)发酵罐液体菌种生产

1.发酵罐清洗。要求罐体内外各个角落都清洗干净,不允许有一点污渍,要上开盖,下开闸,保持罐体干燥备用,不进行空消。

2.发酵料配方。按每升豆粕粉8g,玉米粉5g,豆粉3g,红糖15g,葡萄糖5g,磷酸二氢钾0.2g,硫酸镁0.1g。

3.预加水升温。加水至夹层焊线位置,提前开启蒸汽发生器,0.6MP压力备用,将蒸汽管路中的冷凝水先排入下水管,然后再打开波纹管连接蒸汽管路的阀门,开启发酵罐下面进蒸汽阀门进蒸汽灭菌,当蒸汽遇冷水会产生”振爆”,可适当开启气源阀门通入空气减小”振爆”现象,即减小噪音,又防止设备损坏,同时在通气条件下还能搅拌发酵罐内的水,可以不用达到50℃再添料,有效防止料粘罐底情况。

4.投料定容。将培养料加水搅拌均匀,倒入发酵罐内,添加消泡剂致培养液上面气泡90%以上消失(约250ml),补水至上观察口下沿处,擦净罐囗内外,盖好发酵罐盖,对角均匀旋紧螺丝。

5.灭菌。发酵罐内培养液升至95℃前,需要提前安装上降温、排水波纹管,同时确定好夹层加热棒断电,夹层无水。95℃以上”振爆″不明显后关掉进气气源阀门,当温度升至121℃计时,温度不要超过125℃,保持温度121℃-125℃90分钟。

6.冷却。灭菌时间结束后,先关掉罐底阀门,再关蒸汽管路上阀门,再关蒸汽发生器,不可反向操作,防培养液倒流污染。开启气源阀门通气,当气压超过0.15Mp时,打开夹层进冷水阀门,夹层上囗排水阀门要常开的,或者不安装,接种口阀门关掉,排气阀门要常开,防止误关造成设备损坏。接通加热棒电源,设置到24℃启动,26℃停止。

7.接种工具准备。首先,关阀空调、正压风机等造成接种室内空气流动加速的设备,室内酒精消毒,如果有紫外线灯开启20分钟。随后关紫外线灯,接种要戴一次性橡胶手套,准备抽滤瓶菌种、火焰架、95%酒精棉、两个接种用梯子、半桶干净的水、75%酒精棉及喷壶、灭火用小钢盆或湿毛巾、火机。

8.接种。用75%酒精棉擦拭接种囗围边及接种囗,安装火焰架,点燃酒精棉在火焰保护下把抽滤瓶接管与接种口对接,将排气囗排气管前端单向阀取下,把排气管放入水桶中,关掉气源进气阀门。当罐内压力归零后,打开接种口阀门,将抽滤瓶菌种通过接种管送入发酵罐,抽滤瓶内留少量菌种做镜检、平皿划线检测用。

9.培养。开启气源阀门,当气压升至0.01MP时关闭接种口阀门,拔掉接种管,用酒精喷壶清理接种口,安装上排气管前端单向阀,调整罐内压力0.05-0.1MP培养。贴好品种、接种时间标签。24-26℃培养7-10天即可使用。

10.菌种检测。液体菌种可接菌包数量大,需谨慎多次进行质量检测。

(1)日常检测:每天要检查发酵罐排出的气味、菌球、菌丝形态及浓度变化、设备工作情况等,确保正常培养过程,4天后可取样检测。

(2)发酵罐菌种取样检测:火焰保护下在取样口取灭菌后的空瓶,装约300m l液体菌种。将检测培养基2瓶,PDA培养基平皿2个;灭菌后待接菌料袋2袋及待测液体菌种放入超净工作台,紫外线灭菌20分钟,将液体菌约5~10m倒入检测培养基中置于37℃避光条件下培养24-48小时观察是否有细菌菌膜,用接种铲粘液体菌种在PDA培养基平皿上划四条线置于28℃避光条件下培养12-24小时观察菌丝是否萌发,装液体菌种20ml均匀倒入料袋中置于28℃避光条件下培养12-24小时观察菌丝是否萌发。

(3)显微镜检测:用接种钩另一端直铁丝处粘一滴液体菌种滴到载玻片上,盖上盖玻片制成标本,800倍下观察菌丝有无锁状联合,有锁状联合可正常使用。

11.液体菌种质量标准。 大球盖菇液体菌种整个培养过程中果香味,无异味;菌球均匀无破裂,菌球占比80%以上;取样检测无污染,菌球萌发时间短,菌丝粗壮 ;镜检锁状联合明显。

(四)液体菌种贮藏

1.母种。日常生产时,将母种置于冰箱4℃贮藏即可,如贮藏时间不超过3个月,使用时可取出后活化1-2天直接用于生产使用。

2.抽滤瓶液体菌种。可临时置于冰箱4℃贮藏,为保障菌球活性,贮藏时间不超过15天为宜。

3.发酵罐液体菌种。培养7-10天后,如无法及时生产使用,可将培养温度调低至20℃,同时减少发酵罐通气量,以减缓菌丝生长速度。但整个培养周期不宜超过20天。(作者:山东莒县政务服务中心赵君法,莒县农业技术服务中心门庆永 武辰阳李爱科 姚红燕)